Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника

Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально-биохимическим и хромато-масс-спектрометрическим методами

Осипов Г.А 1 . , Парфенов А.И. 2 , Верховцева Н.В. 3 ,

Ручкина И.Н. 2 , Курчавов В.А. 4 Бойко Н.Б. 1 ,Рогатина Е.Л. 4

1 Научный центр сердечно-сосудистой хирургии, Академическая группа академика РАМН Ю.Ф. Исакова, 2 Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии, 3 Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова, 4 Детская городская клиническая больница №13 им. Н.Ф. Филатова

Ключевые слова: пристеночная микрофлора кишечника человека, хромато-масс-спектрометрический метод, жирные кислоты, биоптаты слизистой оболочки тощей, подвздошной и ободочной кишок, синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона, антибиотикоассоциированная диарея.

В организме человека обитает более 500 видов микробов. Их общая численность составляет 10 14 , что в 10 раз превышает число клеток человека. Большая часть микробов в количестве 1- 2 кг сосредоточена в кишечнике  Luckey, 1987. Понятно, что традиционные методы исследования 10 – 15 видов микрофлоры фекалий не в состоянии отразить реальную картину качественного и количественного состава микрофлоры кишечника.

Развитие в последнее десятилетие молекулярных методов микробиологических исследований дает возможность расширить сведения о видовом составе микробиоты кишечника. Молекулярно-генетический метод гибридизации 16 S r РНК  Hopkins, 2001, в том числе в сочетании с градиентным гель-электрофорезом (DGGE) денатурированных ПЦР-фрагментов (ампликонов) r ДНК  Favier, 2002 применен для контроля бактериальных групп и отдельных видов бактерий (до 18 таксонов) в фекалиях. Метод видоспецифичен, но трудоемок и малодоступен ввиду необходимости индивидуального подбора тестовых олигонуклеотидов для каждой реакции амплификации, либо процедуры клонирования неспецифичных ПЦР-продуктов с последующим секвенированием очищенных плазмид. Тем не менее, ПЦР– DGGE при наличии необходимых стандартов предлагается для мониторинга микроорганизмов в фекалиях.

Метод детектирования микроорганизмов по нелетучим жирным кислотам (ЖК) клеточной стенки микроорганизмов методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС), сродни генетическому, поскольку состав ЖК детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК (Албертс, 1986). Поэтому профиль ЖК бактерий является их визитной карточкой или фингерпринтом, как отпечатки пальцев людей (Митрука, 1978). Он так же консервативен, как строение ДНК, но и так же подвержен мутациям под действием факторов окружающей среды. Стабильность набора жирных кислот, составляющих клетки микробов, подтверждается исследованиями в области бактериальной палеонтологии, которые показывают, что до глубины времен в 2,5 млрд лет состав ЖК отдельных микробов и пула их жирных кислот в целом остается постоянным (Шеховцова, 2002). В отличие от молекулярно-генетического этот метод позволяют быстро получить количественную информацию о большом спектре микроорганизмов Lehtonen, 1995; ChemicalMethods.., 1994; Stead,1992. Метод основан на использовании очень больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов. Особенности состава жирных кислот теперь используются наряду с другими параметрами в бактериальной таксономии Определитель бактерий..,1997 и клинической бактериальной диагностике Вейант, 1999. Фирмой MIDI Inc., Делавер, США серийно выпускается хроматограф Microbial Identification System для автоматической идентификации микроорганизмов по составу ЖК чистой культуры клеток, выращенной в стандартных условиях Stead, 1992.

Ранее нами описаны примеры обнаружения микроорганизмов при инфекционных процессах методом ГХ-МС Осипов, Демина, 1996. Установлено наличие гомеостаза малых молекул микробного происхождения в крови человека, который нарушается при воспалениях  Белобородова, Осипов, 1999; Beloborodova, Osipov, 2000.

Микробиота тонкого кишечника в гастроэнтерологии исследуется крайне редко, в основном при хирургическом вмешательстве. При этом определяют в основном ограниченный круг условно-патогенных микроорганизмов культурально-биохимическим методом в аэробных условиях. Чаще изменения нормальной микробиоты кишечника определяют по составу микроорганизмов в фекалиях. Однако, для оценки дисбиоза более ценной является информация о микробной колонизации в стенке кишечника, которая обеспечивается адгезивными свойствами бактерий. В отличие от микрофлоры фекалий, именно эти микроорганизмы наиболее точно отражают состояние микробной экологии человека Шендеров, 1998. Микрофлора, обладающая адгезивными свойствами, является наиболее жизнеспособной. Она сосредоточена на апикальной мембране энтеро– и колоноцитов, т.е. в зоне ассимиляции нутриентов. Можно предполагать, что изменения ее качественного и количественного состава оказывают влияние на пищеварительно-транспортные процессы в тонкой кишке.

Недавно были опубликованы результаты анализа специфических для микроорганизмов длиноцепочечных клеточных жирных кислот (ЖК) в биоптатах стенки тонкой, подвздошной и ободочной кишок (Осипов, 2001, Парфенов, 2001). Методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии определены ЖК из состава клеточной мембраны и липополисахарида микроорганизмов в биоптатах, полученных во время интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией, у пациентов с синдромом раздраженного кишечника (СРК) и здоровых добровольцев. Одновременно кровь пациентов с СРК исследована на содержание 135 таких веществ, что дает информацию о 170 таксонах микроорганизмов. На основании этих данных рассчитан состав пристеночной микробиоты разных отделов кишечника в сопоставлении с фекалиями и показана адекватность изменения микробных маркеров в крови при СРК.

Предлагаемя работа является продолжением этих исследований и содержит сведения о ряде новых родов микроорганизмов, включенных в алгоритм мониторинга в связи появлением данных по составу их жирных кислот и альдегидов. Эти сведения существенно расширяют возможности клинического приложения метода, так как дополняют результаты информацией по клостридиям, представителям рода Eubacterium , пропионобактериям и руминококкам. Кроме того, при посеве материала биоптатов на питательные среды подтверждено наличие в составе пристеночной микробиоты кишечника выделением в чистой культуре ряда батерий, грибов и аэробных актиномицетов, определенных ранее по жирнокислотным маркерам. В связи с этим внесены коррективы в определение клинического значения изменений состава пристеночной микрофлоры кишечника человека при СРК и антибиотико-ассоциированной диарее (ААД).

Материал и методы исследования

Обследованы 31 больной с синдромом раздраженного кишечника с преобладанием поносов, 18 больных с урогенитальной инфекцией (15 чел), обострением хронического бронхита и очаговой правосторонней пневмонии (3), у которых лечение осложнилось антибиотикоассоциированной диареей и 3 больных болезнью Крона тонкой кишки. Контрольную группу составили 3 добровольца из числа призывников на военную службу.

Исследовали пробы крови и биоптаты слизистой оболочки тощей, подвздошной и ободочной кишок. Биоптаты (1-2 фрагмента слизистой оболочки общим весом до 8 мг) получали во время интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией.

Для верификации метода – то есть для определения соотношения измеряемых концентраций микроорганизмов с данными измерений культуральным и молекулярно-генетическим методами проведено измерение состава фекалий здорового человека.

Принцип метода – молекулярный, основан на прямом определении в биопробе жирных кислот (ЖК) клеточной стенки микроорганизмов. Известно, что 200 микробных ЖК специфичны и обеспечивают определение состава микробиоты слизистых оболочек и очагов воспаленя на преобладающем фоне 20 человеческих ЖК. Метод ГХ-МС и программа расчета обеспечивают количественный мониторинг микробиоты. База данных содержит сведения о профилях ЖК более 1000 видов бактерий, грибов и актиномицетов.

Подготовка пробы и условия культивирования микроорганизмов биоптатов. Биоптаты из стерильных пробирок, в которые производился их отбор при зондировании кишечника, асептически переносили в стерильную фарфоровую ступку и растирали с добавлением стерильной дистиллированной воды. Растертые биоптаты количественно переносили в пробирки с дистиллированной водой. Из разведений 10 –4 – 10 –5 производили посевы суспензий на РПА, РПА 1:10, кровяной агар, bile salt agar , yeast extract agar , starch agar . Чистые культуры микроорганизмов получали путем пересевов при контроле методом световой микроскопии. При анализе анаэробной составляющей кишечной микробиоты пробу сразу после извлечения зонда переносили в пробирку с угольной транспортной средой для анаэробов (фирма) и немедленно доставляли в бактериологическую лабораторию, где проводили посев в пробирку в толщу агаризованных сред или во флаконы BACTEK для анаэробов. Из толщи агаризованных сред колонии вырезали, а взвесь клеток из жидкой среды предварительно центрифугировали. И то и другое подвергали кислому метанолизу после подсушивания вместе с остатками среды. Цельную кровь в количестве 0,05 мл высушивали при добавлении метанола и подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле.

Газовая хроматография – масс-спектрометрия. Метанолиз биоптатов слизистой оболочки в количестве 3-4 мг, проводили в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение одного часа при 80 ° С. В результате реакции метанолиза сложных липидов жирные кислоты освобождаются в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N,О-бис (триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80 ° С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы HP-5973 Аджилент технолоджис (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP –5 ms Аджилент технолоджис . Режим анализа и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли как описано ранее Осипов, Парфенов,2001.

Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе с использованием внутреннего стандарта. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. Для количественного расчета использовали данные калибровки по дейтерированной тридекановой кислоте и чистым культурам клинических изолятов микроорганизмов.

Идентификация микроорганизмов. В изолятах и анаэробных накопительных культурах определение вида микроорганизмов проводили на Microbial Identification System ( MIDI . Inc ., Newark , Del . ). Изоляты идентифицировали по коммерческой базе данных ( MIDI , Inc .) объемом 1800 штаммов, а также с использованием собственной базы данных, включающей около 800 штаммов бактерий, аэробных актиномицетов и микроскопических грибов. ГХ-МС использовали для подтверждения данных хроматографии, идентификации неизвестных компонентов и анализа отдельных колоний, когда количество микроорганизмов оказывалось не достаточным для анализа на ГХ. Морфологию выделенных штаммов контролировали методом световой микроскопии окрашенных препаратов и методом сканирующей электронной микроскопии.

Расчет состава и количества эффективных клеток микроорганизмов. Площадь хроматографического пика маркера пропорциональна его концентрации а следовательно, концентрации соответствующего микроорганизма, которая определяется как число клеток N 1в единице объема или веса пробы по формуле:

N1=Ai Mst/(q2*Msam*Ast)/Ri1 , где выражение в квадратных скобках, постоянный коэффициент

к = Mst/q2/Msam/Ast = Mst(мг)/5,1×10(-15)г/Msam(мг)/Ast

В этих формулах Ai – площадь пика маркера, Mst – количество введенного в пробу стандарта в мг, Msam – соответственно, количество пробы, Ast – площадь пика стандарта, Ri1 – доля в % маркера с индексом i в профиле ЖК определяемого микроба с номером 1 (N1), q2 – коэффициент, равный 5,1×10 (-15) г , в котором содержится основополагающая в пересчете на число клеток величина 5,9х10 12 клеток микробов, содержащихся в 1г микробной биомассы и доля ЖК в клетке, принятая в среднем равной 3%.

Соответственно, число клеток любого следующего микроорганизма можно рассчитать по аналогичной формуле N2= Ai x k / Ri2и так далее, умножая площади пика Ai маркера, по которому проводятся вычисления, на коэффициент k и деля на долю маркера в % в составе ЖК этого микроорганизма.

Таким способом определяли эффективную (то есть соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность бактерий видов Сl. perfringens, C l . difficile, Prevotella , Stenotrophomonas грибов Candida albicans, бактерий родов Klebsiella, Eubacterium, Rhodococcus , Nocardia, Sphingo bacterium, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, сем. Enterobacteriaceae и других, а также неспецифически грибов по эргостеролу (Aspergillus, Mucor и др.). Некоторые бактерии и вирусы вмешиваются в синтез стеринов в клетках человека, что позволяет определять бактерии рода Eubacterium по продукту трансформации человеческого холестерина ее ферментом в копростанол, вирусы герпеса неспецифически по индуцируемому ими метаболиту холестендиолу, цитомегаловирусы – по холестодиенону и изомерам холестадиена. Если вещество не обладает свойством маркера, то есть может быть отнесено к двум или более таксонам, то и в этом случае доля вклада каждого микроорганизма, если воспользоваться решением системы уравнений для двух (или, соответственно, более) веществ. Такой способ описан нами для расчета экологических микробных сообществ Турова, Осипов, 1996, при котором в идовой состав микробного сообщества в общем виде для m веществ хроматограммы и n родов (видов) микроорганизмов можно вычислить, составив систему из m уравнений для n неизвестных:

А1 . k = N1R1,1 + N2R1,2+ N3 R1,3+………+ NnR1,n

А2 . k = N1R2,1 + N2R2,2+ N3R2,3+………+ NnR2,n

А3 . k = N1R3,1 + N2R3,2+ N3R3,3+………+NnR3,n

Аm . k = N1Rm,1 + N2Rm,2+ N3Rm,3+………+ NnRm,n

где A i(i=1,2….m) – площадь пика ,

Nj (j=1,2…n) – число клеток микроорганизмов,

k – коэффициент пропорциональности,

Rij – доля i-того вещества в профиле ЖК j-того микроба.

Результаты и обсуждение

 

Состав и численность пристеночной микробиоты кишечника в сопоставлении с фекалиями

Описанным выше методом определена заселенность слизистой оболочки кишечника (табл. 1), которая оказалась у здоровых людей по порядку величины одинаковой для тощей, подвздошной и толстой кишок (0,6 – 1) ´ 10 11 кл/г и существенно меньше по сравнению с фекалиями (2,7 ´ 10 11 кл/г). Полученная численность для фекалий находится в пределах интервала значений 10 11 -10 12 кл/г, известных из литературных данных (Маянский, Микробиология для врачей, 1999). Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по нашим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений, в пределах 3-6 порядков. Тем не менее, совпадает наша оценка о приоритете рода Eubacterium , численность которых имеет порядок 10 11 кл/г (10 9 – 10 12 по литературным данным), о количестве бактероидов 10 10 кл/г (1010 – 1012 по известным данным), клостридий – 6 х 1010 кл/г (105 – 1011 соответственно), бифидобактерий 1010 кл/г (1010– 1012), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам и стафилококкам. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными приводимые здесь сведения о составе микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки.

Таблица 1.

Состав микроорганизмов стенки кишечника и в фекалиях по группам

Группы и таксоны микроорганизмов

Численность, кл/г, ´ 10 6

Тощая

Подвздошная

Ободочная

Фекалии

Кокки, бациллы, коринебактерии
Streptococcus 261 253 1170 1691
Bacillus cereus 0 51 157 284
Bacillus megaterium 90 0 0 0
Corineform(Listeria) а17 1398 439 713 65
Staphylococcus 616 410 490 121
Streptococcus 1642 127 2 641

Сумма

4006 1281 2533 2803
Анаэробы
Eubacterium lentum 98 675 670 4334
Clostridium hystolyticum 692 467 849 388
Peptostreptococcus anaerobius 487 330 423 37
Clostridium propionicum 127 150 0 13942
Bacteroides hypermegas 0 0 0 163
Clostridium ramosum 3892 1942 118 0
Fusobacterium/Haemophylus 0 0 0 129
Porphyromonas 0 0 0 39
Lactobacillus 17355 17190 16231 30510
Eubacterium moniliforme 0 0 0 892
Cl.difficile 1769 861 1055 684
Prevotella 620 583 345 7557
Eubacterium/Enterococcus 6832 11497 24457 12026
Bacteroides fragilis 0 63 43 1340
Bifidobacterium 5249 7108 31886 10723
Clostridium perfringens 224 50 43 44698
Eubacterium 27 1548 3549 93218
Eubacterium sp 12777 1057 13086 3648
Propionibacterium acnes 0 0 359 388
Ruminicoccus 804 800 1364 30
E.lentum 7741 93 56 0 282
Bacteroides ruminicola 0 7 9 2769
Eubacterium spp. 365 265 5650 9725
Propionibacterium 0 0 0 698

Сумма

52520 44648 100138 238219

Аэробные актиномицеты

Nocardia, 14:1d11 1595 0 1136 7
Актиномицеты 797 289 105 0
Pseudonocardia 215 7 85 34
Streptomyces 493 392 329 1522
Rhodococcus 1588 792 698 127
Mycobacterium/Candida 3025 3184 3257 0
Actinomadura 151 0 12 0
Nocardia asteroides 1782 0 609 108
Actinomycetes 10Me14 3652 3196 2328 92

Сумма

13297 7859 8558 1891
Грам (-) палочки
Acinetobacter 0 0 0 125
Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 42
Stenotrophomonas maltophilia 0 0 0 24

Сумма

0 0 0 191
Энтеробактерии и энтерококки
Klebsiella 2h14 146 261 190 84
Campylobacter mucosalis 0 0 0 18
E.coli 20 21 25 0
Helicobacter pylory, h18 529 141 92 2134
Enterococcus 783 484 1252 669
Enterococcus faecalis 0 0 530 4649

Сумма

1478 907 2089 7554
Микроскопические грибы
Микр грибы (кампестерол) 216 375 112 1430
Микр грибы (ситостерол) 197 422 56 888
Микр грибы (эргостерол) 0 0 0 286

Сумма

413 797 168 2604
Вирусы
Herpes 216 113 203 0
Цитомегаловирус 919 31 26 8

Сумма

1135 144 230 8
Не идентифицированы
Маркер i14 0 840 92 15192
Маркер i17 3066 1549 0 2061

Сумма

3066 2389 92 17253

Общая сумма

75915 57772 112637 270523

  По данным табл. 1 общая удельная численность микроорганизмов в пристеночном слое ободочной кишки (далее будем говорить просто в ободочной или другой кишке, имея в виду биоптат кишечной стенки вместе с мукозным слоем) в два с половиной раза меньше, чем в фекалиях, но доля анаэробов так же составляет 89%. Однако родовой состав внутри группы анаэробов иной, чем в фекалиях. На стенке больше втрое концентрация бифидобактерий, но меньше лактобацилл и эубактерий. Причем у последних изменен и видовой состав по сравнению с фекальным. Интересно отметить, что концентрация C . perfringens на три порядка меньше в пристеночном слое как ободочной, так и подвздошной кишки, чем в фекалиях, но снова увеличивается в тощей. Это означает практически, что фекалии являются основным местообитанием этих бактерий, а также С. propionicum. Другие клостридии, C . hystolyticum и C . difficile сохраняют порядок величины по отделам кишечника и в фекалиях (около 10 3 ), а C . ramosum не обнаруживается в фекалиях, но ее численность ратет от 10 8 в ободочной до 10 9 в тощей кишке.

Следующей по численности группой в фекалиях являются факультативные анаэробы – энтеробактерии и энтерококки, в основном, за счет E . faecalis , который не обнаруживается в подвздошной и тощей кишках, тогда как прочие энтерококки, хеликобактер и клебсиеллы равномерно заселяют кишечник и фекалии. E . coli и другие бактерии сем. Entrobacteriaceae в норме обнаруживаются методом ГХ-МС только в кишечной стенке, а Campylobacter mucosalis – только в фекалиях.

Существенную долю микробиоты тощей кишки (1,3х 10 10 кл/г, в фекалиях – на порядок меньше) составляют аэробные актиномицеты. В предыдущей работе, при неполном учете анаэробов, их доля оказалась относительно завышенной – около 50% вместо 17% по данным табл 1. В специализированных лабораториях подтверждено их наличие на слизистых оболочках и коже человека и животных, а также их участие в воспалительных процессах. Они не доступны рутинному контролю в рядовых клинических лабораториях, однако, благодаря наличию уникальных молекулярных маркеров могут быть обнаружены и количественно измерены методом масс-спектрометрии.

Далее по численности следуют аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки и коринеформные бактерии) – около 5% в тощей кишке и 1% в фекалиях.

Плотность заселения стенки кишечника в дистальном направлении меняется мало: в подвздошной кишке она в два раза меньше, а в толстой в полтора раза больше, чем в тощей. Измеренная нами пристеночная микрофлора оказалась существенно более концентрированной, чем просветная (по литературным данным (Маянский, Микробиология для врачей, 1999), , которая в тонкой кишке на шесть порядков ниже по численности (до 10 5 кл/мл,), в подвздошной кишке – на порядок выше.

Неожиданным результатом, несомненно, является обнаружение значительного количества аэробных актиномицетов. Специфичность их маркеров – разветвленных жирных кислот с метильной группой в положении Δ10 не позволяет предполагать какие-либо иные таксономические группы микроорганизмов, кроме представителей порядка Actinomycetales , содержащих в составе клеточной стенки миколовые кислоты, являющиеся источником 10-метилразветвленных ЖК. Они содержаться в микобактериях, нокардиях, родокках, Actinomadura spp . и других актиномицетах, но не найдены у высших органзмов (в грибах, растениях, животных). Присутствие этих молекул в биоптатах кишечника, крови и других органах и жидкостях человека подтверждается масс-спектрами в хроматографическом пике и относительным хроматографическим временем удерживания, а также их анализом в составе музейных культур соответствующих микроорганизмов. Бактерии родов Streptomyces и Nocardiopsis подтверждены также уникальным маркером изо-гексадекановой кислотой (i 16). Кроме того, профиль разветвленных ЖК специфичных для стрептомицетов выявлен в крови септических больных в нашей практике, а Nocardiopsis dassonvilley выделен в чистой культуре из кишечника в настоящем исследовании. Список актиномицетов на самом деле шире, чем это показано в первой группе табл. 7. Сюда следует добавить анаэробные актиномицеты и близкие к ним микроорганизмы. Это Propionibacterium , Actinomyces , Brevibacterium , которые также выделены в чистой культуре и коринеформные бактерии. Наконец, если учесть, что до настоящего времени в некоторых руководствах по микробиологии, как и ранее  Определитель бактерий.., 1997 , род Bifidobacterium относят к семейству Actinomycetaceae , то окажется, что актиномицеты занимают существенное место в пристеночной микробиоте кишечника. Такая оценка повышает значимость микробиоты кишечника для организма хозяина, так как актиномицеты превосходят все прочие микроорганизмы по продукции антибиотиков и витаминов и обладают мощным ферментативным аппаратом. Высокая степень колонизации кишечника актиномицетами не выглядит необычным явлением, если иметь в виду, что актиномицеты широко распространены в окружающей среде – почве, воде, воздухе, на внутренних стенах жилых и производственных помещений. Их обитание в организме человека при таких обстоятельствах выглядит естественным. Действительно, в руководствах по клинической микробиологии отмечается обнаружение актиномицетов и родственных организмов, таких как Mycobacterium, Actinomadura, Propionibacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Bifidobacterium в кишечнике и других органах человека. Там они известны (в том числе и бифидобактерии) как участники инфекционных и воспалительных процессов. Однако эти проявления актиномицетов (патогенность, чувствительность к антибиотикам, способы лечения) являются предметом единичных специализированных лабораторий и клиник в мире. Трудности в их бактериальной диагностике и культивировании послужили препятствием широкой известности этих микроорганизмов в клинической практике. В том числе при многочисленных заболеваниях, связанных с изменением микробиоты кишечника.

При периодическом посеве биоптатов разных пациентов на питательные среды в аэробных условиях было выделено 52 штамма бактерий, аэробных актиномицетов, дрожжей и грибов. По данным световой и электронной микроскопии колоний, биохимическим тестам, профилям жирных кислот при подтверждении идентификации методом ГХ-МС выявлено 27 таксонов на уровне рода или вида (в скобках – число видов): Таблица 2

Перечень родов микроорганизмов, выделенных в чистом виде и идентифицированных при посеве биоптатов кишечника на питательные среды (в скобках – число видов, если больше одного)

  • Acinetobacter
  • Actinomyces
  • Alcaligenes
  • Aspergillus
  • Bacillus (8)
  • Bacteroides
  • Bifidobacterium
  • Brevibacterium
  • Campylobacter
  • Candida (2)
  • Chriseobacterium
  • Citrobacter
  • Comamonas
  • Enterococcus
  • Enterobacter
  • Helicobacter
  • Lactobacillus
  • Leiconostoc
  • Nocardiopsis
  • Ochrobactrum
  • Penicillum
  • Peptostreptococcus
  • Propionibacterium
  • Pseudomonas (3)
  • Proteus
  • Stenotrophomonas
  • Streptococcus

  Идентификация проведена по профилям клеточных жирных кислот. Часть изолятов идентифицировали для проверки культурально-биохимическим методом (табл. 3 )

Таблица 3

Сопоставление данных идентификации микроорганизмов кишечной стенки культурально – биохимическим и хроматографическим методами

 

Штамм ГХ-система Шерлок Биохимический метод

Pseudomonas stutzeri P.aeruginosa

3B

Stenotrophomonas maltophilia S.maltophilia

2B

Proteus mirabilis Enterobacter cloacae

3A

Chriseobacterium meningosepticum Ch.meningosepticum

1B

Enterobacteriacea sps E.cloacae

4A

Bacillus atrophacus Грам+ палочки

1 A

Alcaligenes xylosooxydans Alcaligenes faecalis

3C

Ochrobactrum anthropii O . anthropii

  Микрофотографии приведены на рис 1 (микроскопический гриб) и 2 (актиномицет Nocardiopsis dassonvillei ).

Рис 1. Микрофотография гриба из пристеночного слоя кишечника. Сканирующий электронный микроскоп.  

  Рис 2. Микрофотография двух колоний аэробного актиномицета Nocardiopsis dassonvillei из пристеночного слоя кишечника. Сканирующий электронный микроскоп.  

В таблицу 2 включены два представителя анаэробной микрофлоры: Peptostreptococcus anaerobius , выделенный в анаэростате и Actinomyces viscosus , выявленный в накопительной культуре при посеве в бутылочки BACTEC на среду для анаэробов. Эти организмы определены методом ГХ-МС по составу ЖК. Обнаружены маркеры бактерий группы Bacteroides fragilis (3 hi 17, 3 h 16 и i 15) и лактобацилл (16:1 DMA и 19 cyc 11,12). Им сопутствуют аэробы Stenotrophomonas (маркер i 11:0), Eikenella (предполагается по паре маркеров 3 h 10 и 3 h 12 при отсутствии 2 h 12), и представители семейства Enterobacteriaceae, судя по одновременному присутствию их известных маркеров: β-оксимиристиновой кислоты (3 h 14), цис-вакценовой (18:1 w 7) и циклогептадекановой кислоте (17 cyc ). В другой пробе удалось выявить Propionibacterium avidum по профилю разветвленных жирных кислот – этот микроб был выделен и при посеве в аэробных условиях, поскольку является аэротолерантным организмом. Основная часть профиля жирных кислот этой пробы (прямоцепочечные ЖК) наиболее близка к Pseudomonas alcaligenes .

Изменение микрофлоры тонкой кишки при ААД

У 17 больных ААД исследованы 50 микроорганизмов, концентрация которых определена по молекулярным маркерам непосредственно в биоптате слизистой оболочки кишки (табл 4). Существенные (более, чем в два раза) отклонения в численности колонизации претерпевают многие микроорганизмы – 13 из 55 контролируемых. Особенно часто увеличивается концентрация Streptococcus (14 из 17), Eubacterium lentum (12), Bacillus cereus 12), Acinetobacter (10), Pseudomonas aeruginosa (12), Campylobacter mucosalis (12), Eubacterium/Enterococcus (11), Bacteroides fragilis (10), Eubacterium (10), Propionibacterium acnes (15) и микросокопических грибов (10), продуцирующих ситостерол и кампестерол.

Увеличение численности Cl . difficile не наблюдалось. Но обнаруживали превышение нормы колонизации Cl . Perfringens (6 из 17) и Cl . propionicum (5 из 17). Однако, основной тенденцией синдрома является уменьшение численности большинства микроорганизмов, – 25 из 55 контролируемых более чем в 50% случаев. Регулярно уменьшалась численность анаэробного пептострептококка, большинства видов эубактерий, энтеробактерий и аэробных актиномицетов. Отсюда следует, что причиной ААД является не определенный инфекционный агент, в частности, Cl . difficile, а скорее неспецифическое изменение нормальной микрофлоры тощей кишки. Такая ситуация представляется более правдоподобной по сравнению с моноэтиологичным вариантом. Действительно, пациенты принимали различные антибиотики и трудно представить, что у всех оказывался резистентным только один оппортунистический микроорганизм – Cl . difficile .

Таблица 4

Количество случаев более чем двукратного превышения нормы (>2 N ) численности микроорганизмов в тонком кишечнике и соответственно ее уменьшения более чем вдвое (<0,5 N ) при СРК и ААД

ААД (n=17) СРК (n=30)
Микроорганизм >2N <0.5N >2N <0.5N
1 Streptococcus 14 23
2 Eubacterium lentum, i16a 12 23
3 Bacillus cereus 12 19
4 Баланс 5 0 11 0
5 Clostridium hystolyticum 2 15 3 26
6 Nocardia, 14:1d11 4 11 7 20
7 Peptostreptococcus anaerobius 0 17 1 30
8 Acinetobacter 10 0 18 0
9 Pseudomonas aeruginosa 12 0 22 0
10 Propionibacterium 2 0 3 0
11 Bacillus megaterium 1 16 2 29
12 Clostridium propionicum 5 9 9 14
13 Stenotrophomonas maltophilia 4 0 8 0
14 Bacteroides hypermegas 2 0 3 0
15 Актиномицеты 0 16 1 29
16 Pseudonocardia 5 8 8 16
17 Streptomyces 3 12 5 24
18 Clostridium ramosum 4 13 8 23
19 Fusobacterium/Haemophylus 0 0 6 0
20 Klebsiella 2h14 3 4 5 12
21 Репер 0 0 0 0
22 Flavobacterium 4 0 11 0
23 Rhodococcus 2 12 3 23
24 Баланс 10 0 18 0
25 Porphyromonas 7 0 15 0
26 Corineform(Listeria) а17 2 10 4 16
27 Lactobacillus 4 10 7 14
28 Campylobacter mucosalis 12 0 22 0
29 Mycobacterium/Candida 1 13 3 23
30 E.coli 3 13 10 19
31 Eubacterium moniliforme 3 0 6 0
32 Cl.difficile 1 12 3 20
33 Actinomadura 0 13 3 24
34 Prevotella 0 17 1 29
35 Eubacterium/Enterococcus 11 3 18 7
36 Bacteroides fragilis 10 0 15 0
37 Staphylococcus 2 6 7 11
38 Bifidobacterium 5 6 6 10
39 Helicobacter pylory, h18 0 0 1 0
40 Clostridium perfringens 6 7 9 16
41 Enterococcus 3 5 10 10
42 Eubacterium 10 1 21 3
43 Eubacterium sp. A17a 3 7 7 11
44 Streptococcus 1 12 2 20
45 Herpes 5 8 9 16
46 Микр грибы 10 6 16 10
47 Nocardia asteroides 3 9 7 16
48 Цитомегаловирус 0 16 2 28
49 Микр грибы 9 3 20 5
50 Propionibacterium acnes 15 0 27 0
51 Ruminicoccus 7 6 14 11
52 Actinomycetes 10Me14 0 16 1 29
53 E.lentum 7741, 14a 1 15 2 28
54 Enterococcus faecalis 5 0 9 0
55 Bacteroides ruminicola 0 0 0 0
56 Eubacterium spp. 2 10 6 18
57 Микр грибы 0 0 0 0

  Изменение микрофлоры тонкой кишки у больных СРК с преобладанием диареи

Как видно из табл 4 при СРК наблюдаются такие же изменения, как и в случае ААД. Обследовано большее число пациентов, но значительная часть из группы ААД входит в группу больных с синдромом раздраженного кишечника. В связи с этим можно высказать предположение, что СРК с преобладанием поносов является одним из последствий интенсивного лечения антибиотиками. Все перечисленные микроорганизмы являются естественными обитателями кишечника, поэтому в пределах чувствительности метода (в данном случае 10 5 кл/г) фактически наблюдается изменение количественного состава микроорганизмов, колонизирующих в норме кишечник, что обычно называется дисбиозом.

Как показывают параллельные измерения концентрации микробных маркеров в крови у тех же пациентов, у которых исследовались биоптаты тонкого кишечника, тенденция изменения их концентрации совпадает. На рис. 3 сопоставлены данные измерений маркеров бактерий в биоптате тощей кишки и в крови у больного СРК. На анализ взяты: биоптат слизистой кишечника – 4 мг и кровь из пальца – 50 мг. Как правило, концентрация микробных маркеров меняется синхронно в крови и слизистой оболочке кишечника, что позволяет предположить возможность оценки дисбиоза по составу молекулярных компонентов микроорганизмов в крови, что практически реализовано в рутинной диагностике.

 

Рис 3. Сопоставление дисбиоза кишечника по микробным маркерам в крови и в биоптате тощей кишки (клеток/мл х10 6 ). Противофазные кишечнику изменения концентрации маркеров Cl . Ramosum , бифидобактерий, стрептококков и руминококков связаны с их доминирующим избыточным ростом в толстом кишечнике.  

Выводы

1.    Полученная численность для фекалий находится в пределах интервала значений 10 11 -10 12 кл/г, известных из литературных данных. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными полученные сведения о составе микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки.

2.    Состав микробиоты существенно и специфически меняется при заболеваниях кишечника. Возможность его количественного и экспрессного мониторинга методом ГХ-МС (в том числе – по крови) дает возможность выбора адекватного лечения и контроля его эффективности.

3.    Следует обратить внимание на существенную долю эубактерий (род Eubacterium) среди других микроорганизмов кишечника (27% в тощей и 16% в ободочной кишках) и их специфическое видовое изменение при заболеваниях. Учитывая их физиолого-биохимическую активность, можно ожидать не меньшего, чем от регуляции численности бифидобактерий и лактобацилл эффекта на лечение кишечных патологий.

4.    Концентрация стрептомицетов, родококков и других представителей порядка Actinomycetales в десятки раз увеличивается и/или уменьшается при патологических состояниях. Представляется перспективной разработка и использование для нормализации микробиоза кишечника пробиотиков и пребиотиков на основе этой группы (а также других) бактерий.

5.    Увеличение в десятки раз концентрации маркеров лактобацилл и бифидобактерий при некоторых болезнях побуждает к дифференцированному применению широко распространенных пробиотиков на основе этих бактерий.

Литература

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М. Мир. 1986.

2. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином. Вестник РАМН. –1999. T.16, –№7, с. 25-31.

3. Вейант Р., Мосс У., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар М. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. М. Мир, 1999, С. 612-783

4. Маянский . 1999. Микробиология для врачей.

5. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М. Медицина, 1978.

6. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж.Хоулта и др. М.Мир, 1997, т.1,2, 638с.

7. Осипов Г.А. Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах. Вестник РАМН. –1996. Т.13, №2, с.52-59.

8. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Богомолов П.О. Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и биоптатах слизистой оболочки кишечника. Российский гастроэнтерол.журнал. 2001, 1: 54-69.

9. Парфенов А.И., Осипов Г.А., Богомолов П.О. 2001. Дисбактериоз кишечника: новые подходы к диагностике и лечению. Consilium medicum. 3 (6), 270-272.

10. Турова Е.С., Осипов Г.А. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине. Микробиология, 1996, 65(5), 682-689.

11. Шендеров Б.А., Медицинская микробная экология и функциональТом 1: Микрофлора человека и животных и ее функциию– М: Издательство ГРАНТЪ, 1998 , – 288 с .

12. Шеховцова Н.В., Осипов Г.А., Верховцева Н.В., Певзнер Л.А. Анализ липидных биомаркеров в породах архейского кристаллического фундамента. Международная конференция по бактериальной палеонтологии. Тезисы докладов. Москва, 24-25 мая 2002г.

13. Chemical Methods in Procariotic Systematics (1994) ( Goodfellow, M. and O’Donnell, A.G., Eds.), John Willey and Sons, .Chiduster, UK .

14. Beloborodova N.V., Osipov G.A. 2000. Small molecules originating from microbes(SMOM) and their role in microbes-host relationship. Microb. Ecol.Heal.Dis., SCUP, 12: 12-21.

15. Brondz I. , Olsen I. (1991) Multivariate analyses of cellular fatty acids in Bacteroides, Prevotella , Porhyromonas, Wolinella and Campylobacter spp . J.Clin.Microb., V 29 (1): 183-89.

16. Dennemont J., Roupas A., Heitz M. Differentiation of Campylobacter jejuni , C.coli , C.lary and C.fetus fatty acid profiles obtained by gas chromatography – mass spectrometry and by their hippurate hydrolysis. // Mitt. Geb.Lebensmittelunters.Hyg.– 1992.-Vol.83.-N2.-P.142-150.

17. Favier C.F., Vaugham E.E., De Vos V.M., Akkermans A.D.L. 2002. Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates. Appl.Environ.Microbiol., 68 (1) 219-226.

18. Hart CA . Antibiotic resistance: An increasing problem? Br Med J 1998;316:1255-6 (editorial) .

19. Hopkins MJ, Sharp R, Macfarlane GT. 2001. Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut Feb;48(2):198-205

20. Lehtonen L., Eerola E., Oksman P. Muramic acid in peripherial blood leukocytes of healthy human subjects. J.Infect.Dis. 1995. 171, 1060-1064. .

21. Luckey T.D. 1987. Overview of gastrointestinal microecology. Die Narung, ,vol.31,N 5-6.

22. McNabb A., Shuttleworth R., Behme R. et al. Fatty acid characterization of rapidly growing pathogenic aerobic actinomycetes as a means of identification. J.Clin.Microbiol. 1997, v.35, N.6, p.1361-1368.

23. Stead, D.E., Sellwood, J.E., Wilson, J., et al. Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria.// J.Appl.Bacteriol. 1992, 72, 315-321.

ИСТОЧНИК

Один комментарий к записи «Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника»

Комментарии закрыты.